Immunaktive DNA und RNA
Bereich A: Immunaktive DNA und RNA
A1 Lehrstuhl für Biochemie III, Genzentrum
Mechanismus der Inhibition und Regulation der antiviralen RNA-Helicase MDA-5 durch V‑Proteine und LGP2 (Fortführung von Projekt A4 aus der ersten Förderperiode)
Prof. Dr. rer. nat. Karl-Peter Hopfner
Diplom-Biologe, Fachrichtung Biochemie und Strukturbiologie
Leiter, Lehrstuhl für Biochemie III
Genzentrum am Department Chemie und Biochemie
Ludwig-Maximilians-Universität München
Feodor-Lynen-Straße 25, 81377 München
Tel. 089-2180-76-953, Fax -76-999, hopfner(at)lmb.uni-muenchen.de
1.1 Ziele und Arbeitsprogramm
Folgende Fragestellungen werden bearbeitet:
1. Welche Nukleinsäurederivate binden an die regulatorische Domäne von MDA-5? Dazu wollen wir eine Reihe von Kandidatenmolekülen testen und die Bindungsstärken durch Fluoreszenz-anisotropie charakterisieren.
2. Wie wird MDA-5 durch V-Proteine inhibiert?
3. Wie stimuliert LGP2 MDA-5? Dazu wird die Bildung von Komplexen auf RNA untersucht und getestet, ob LGP2 auf die ATPase-Aktivität oder RNA-Interaktion von MDA-5 Einfluss nimmt.
1. Expression und Reinigung der regulatorischen Domäne von MDA-5. Fluoreszenzanisotropie und Kompetitionsassays einer Reihe von RNA- und RNA-DNA-Hybridoligonukleotiden. Kokristallisation und Strukturbestimmung. Effekt von viralen RNAs auf die ATPase-Aktivität von MDA-5.
2. Kokristallisation von Domänen von MDA-5 und V-Proteinen
3. Dünnschichtchromatographie (ATPase), EMSA und Fluoreszenz-Anisotropiemessungen von RNA-Bindung und ATPase-Aktivität des MDA-5-Proteins in Gegenwart von LGP2
1.2 Geplante Promotionsprojekte im Kolleg
1. Struktureller Mechanismus der Inhibition von MDA-5 durch V-Proteine und Charakterisierung der Ligandenspezifität der MDA-5 regulatorischen Domäne.
2. Struktureller Mechanismus der Aktivierung von RIG-I-artigen Helikasen anhand des LGP2‑dsRNA-Komplexes.
1.3 Vorhandene Methoden
a) Proteinexpression in E. coli und Insektenzellen, b) Proteinreinigung mit FPLC- und HPLC‑Techniken, c) Proteinkristallisation, d) Röntgenkristallographie, Phasenbestimmung und Modellbau, e) Röntgenkleinwinkelstreuung und ab initio-Modellierung, f) Fluoreszenz-Anisotropiemessungen von RNA-Protein-Komplexen, g) biochemische Charakterisierung von Protein-Nukleinsäurekomplexen, h) generelle in vitro biochemische Techniken.
A3 Abteilung für Klinische Pharmakologie, Arbeitsgruppe Intrazelluläre Immunität
Erkennung viraler Infektionen durch zytoplasmatische Nukleinsäure-Rezeptoren des angeborenen Immunsystems
Dr. rer. nat. Andreas Schmidt
Diplom-Biologe
Abteilung für Klinische Pharmakologie
Medizinische Klinik und Poliklinik IV, Klinikum der Universität München
Ziemssenstraße 1, 80336 München
Tel. 089-5160-7326, Fax -7330, andreas.schmidt(at)med.uni-muenchen.de
PD Dr. med. Simon Rothenfußer
Arzt, Leiter der Arbeitsgruppe „Intrazelluläre Immunität“
Medizinische Klinik und Poliklinik IV, Klinikum der Universität München
Ziemssenstraße 1, 80336 München
Tel. 089-5160-7331, Fax -7330, simon.rothenfusser(at)med.uni-muenchen.de
3.1 Ziele und Arbeitsprogramm
Grundlegende Fragen zu den physiologisch relevanten RNA-Liganden für RIG-I und MDA-5 im Rahmen einer viralen Infektion und der Funktion von LGP2 sind noch ungeklärt.
Folgende Fragestellungen werden bearbeitet:
1. Welche RNA-Liganden binden im Verlauf einer viralen Infektion tatsächlich an den Rezeptor RIG-I?
2. Was ist der Mechanismus der LGP2-vermittelten MDA-5 Aktivierung?
3. Was ist die funktionell/strukturelle Grundlage der Assoziation von Polymorphismen in RIG‑I‑like-Helikasen mit dem Verlauf einer Hepatitis-C-Infektion?
3.2 Geplante Promotionsprojekte im Kolleg
1. Identifizierung und Analyse physiologischer RNA-Liganden von RIG-I.
2. Untersuchung des Mechanismus der LGP2-vermittelten MDA-5-Aktivierung.
3. Funktionelle und mechanistische Untersuchung des mit spontaner Ausheilung einer
HCV‑Infektion assoziierten Polymorphismus im MDA-5-Gen.
3.3 Vorhandene Methoden
a) Klonierung und zielgerichtete Mutation von Genen, Western blot, Immunpräzipitation von Protein-Protein- und Protein-RNA-Komplexen, b) ELISA zur Detektion von Zytokinen in Zellkulturüberständen und Seren, c) real-time-PCR zur Expressionsanalyse von Genen, dem Nachweis viraler RNA und zur SNP-Analyse, d) sterile Zellkultur, Isolation von Zellpopulationen über Microbeads, transiente Transfektion von Zellen, Herstellung stabiler Zelllinien.
A4 Abteilung für Klinische Pharmakologie, Arbeitsgruppe Immun-regulation
Modulierung der T-Zell-Migration durch immunstimulatorische DNA und RNA
Dr. med. David Anz
Assistenzarzt in der Abteilung für Klinische Pharmakologie
Medizinische Klinik und Poliklinik IV, Klinikum der Universität München
Ziemssenstraße 1, 80336 München
Tel. 089-5160-7324, Fax -7330, david.anz(at)med.uni-muenchen.de
Prof. Dr. med. Stefan Endres
Internist, Gastroenterologe, Klinischer Pharmakologe, Fachimmunologe (DGfI)
Leiter der Abteilung für Klinische Pharmakologie
Medizinische Klinik und Poliklinik IV, Klinikum der Universität München
Ziemssenstraße 1, 80336 München
Tel. 089-5160-7300, Fax -7330, endres(at)lmu.de
4.1 Ziele und Arbeitsprogramm
Ziel des vorliegenden Projekts ist die Klärung der Frage, ob Oligonukleotide und andere RNA-Moleküle als Liganden für RIG-I-Helikasen, die Differenzierung und die suppressive Funktion regulatorischer T-Zellen beeinflussen.
Folgende Fragestellungen werden bearbeitet:
1. Welche Auswirkung hat die Applikation von 5’-Triphosphat-RNA und poly(I:C) auf die Anzahl und den Phänotyp regulatorischer T-Zellen in vivo?
2. Welche Auswirkung hat die Applikation von 5’-Triphosphat-RNA und poly(I:C) auf die Funktion regulatorischer T-Zellen?
3. Kann eine mögliche Inhibition regulatorischer T-Zellen durch Liganden von RIG-I oder MDA-5 das Auftreten von Autoimmunerkrankungen begünstigen?
4.2 Geplante Promotionsprojekte im Kolleg
1. Auswirkung von 5’-Triphosphat-RNA und poly (I:C) auf die Anzahl und den Phänotyp regulatorischer T-Zellen in vivo.
2. Auswirkung von 5’-Triphosphat-RNA und poly (I:C) auf die Funktion regulatorischer T‑Zellen.
3. Auslösung von Autoimmunität durch Behandlung regulatorischer T-Zellen mit Liganden für RIG-I oder MDA-5.
4.3 Vorhandene Methoden
a) in vivo-Applikation von immunstimulatorischen Oligonukleotiden in der Maus (Liganden für TLRs 3, 7 und 9, RIG-I und MDA-5), b) Untersuchung von Zelloberflächenmarkern mittels Durchflusszytometrie, c) Detektion von regulatorischen T-Zellen durch Immunhistologie in murinen Geweben, d) magnetische Zellseparation regulatorischer T-Zellen, e) Proliferations-bestimmung mittels BrdU-Inkorporationsmethode, f) SCID CD45RB-Transfermodell.