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AG Immuntherapie

Leitung

Prof. Dr.med. Dr.phil. Fuat Oduncu, MA, EMB, MBA

Mitarbeiter

  • Prof. Dr. rer. nat. G. Fey


Duales Targeting mittels Tripelbodies

Zu einer effektiveren Behandlung der Akuten Myeloischen Leukämie (AML) müssen neue Therapeutika entwickelt werden, die länger anhaltende Therapieerfolge und tiefere Remissionen mit geringeren Nebenwirkungen erzielen als vorhandene Verfahren. Hierzu kommen Antikörper-Derivate in Betracht, die neben der Masse der Leukämiezellen auch einen gezielten Angriff auf diejenigen Zellen gestatten, welche die bisherige Therapie überleben und die Minimale Restkrankheit (MRD) sowie die Rezidive bedingen. Die derzeit führende Ansicht ist, dass die MRD Zellen weitgehend identisch mit den sog. "AML Leukämie-Stammzellen" (LSCs) sind. Um bessere Therapie-Erfolge zu erzielen, müssen also die AML-LSCs gezielt mit elimi-niert werden. Neue Erkenntnisse über den Immun-Phänotyp der AML-LSCs erlauben es, Antikörper-abgeleitete Therapeutika zur gezielten Elimination der AML-LSCs zu entwerfen.

Ein Molekül, das einen gezielten Angriff auf die AML-LSCs ermöglichen sollte, ist der vom Antragsteller mitentwickelte "single-chain Triplebody 33-16-123". Dieses Antikörper (Ak)-Derivat besitzt Bindestellen für die Antigene CD123 und CD33 auf der Ober-fläche der AML-Zellen sowie für CD16, ein "Trigger-Molekül" auf Natürlichen Killer-zellen (NK-Zellen), welches es gestattet, diese zur Beseitigung der AML Zellen zu rekrutieren. Das Antigen-Paar (CD123, CD33) liegt sowohl auf der Masse der AML-Zellen der meisten Patienten, als auch mit ca. 10-fach erhöhter CD123-Dichte auf ihren AML-LSCs vor. In Vorarbeiten bewirkte der Triplebody 33-16-123 eine potente NK-Zell-vermittelte Elimination maligner Zellen aus Knochenmark und peripherem Blut von AML-Patienten. Für andere Triplebodies im selben Format wurde gezeigt, dass durch das Prinzip des "dualen Targetings", d.h. der gleichzeitigen Bindung an 2 verschiedene Zielantigene auf derselben Krebszelle, eine präferentielle Lyse Antigen-doppelt-positiver vor gleichzeitig vorliegenden Antigen-einfach-positiven Zellen erzielt wird.

Diesem Projekt liegt die Hypothese zugrunde, dass aufgrund der Unterschiede im Immunphänotyp der AML-LSCs und der Masse der AML-Blasten durch "Duales Targeting" eine Triplebody-vermittelte Lyse der AML-LSCs und sogar eine präferentielle Lyse der LSCs vor der Masse der Blasten möglich sein sollte. Zentrales Ziel des Projekts ist es, diese Hypothese für den Triplebody 33-16-123 zu testen. AML-LSCs lieben überwiegend im Kompartiment der CD34-positiven, CD38-negativen (34pos 38neg) Zellen vor. Hier sollen durchflusszytometrische Methoden entwickelt werden, die es gestatten zu verfolgen, ob der Triplebody dieses Subkompartment von AML-Zellen zu eliminieren vermag, und sogar präferentiell vor der Masse der AML-Zellen desselben Patienten zu eliminieren. Zellen von Patienten mit unterschiedlichen Sub-Typen der AML sollen studiert werden um zu ermitteln, ob der Triplebody für bestimmte Subtypen der AML verstärkt wirksam ist oder eine breite Wirkung für verschiedene Subtypen zeigt. In einer longitudinalen Studie mit Zellen desselben Patienten, die zu verschiedenen Stadien des Krankheitsverlaufs entnommen werden, soll sodann untersucht werden, ob seine Zellen in allen Stadien gleich sensitiv sind, oder ob eine Stadien-spezifische Suszeptibilität zu verzeichnen ist.

Weiter soll untersucht werden, ob eine bevorzugte zytolytische Wirkung ("Selektivität") für CD123- und CD33-doppelt-positive Zellen gegenüber gleichzeitig vorliegenden einfach-positiven Zellen erzielt wird. Schließlich wird studiert, ob eine zytolytische Wirkung des Triplebodies mit Vollblut eines Patienten nachweisbar ist, und ob sich aus derartigen Tests Hinweise auf eine Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren ergeben. Im zweiten Teil des Projekts soll die zytolytische Aktivität des Triplebodies vergleichend mit anderen Ak-Therapeutika gegen die AML studiert werden, um dadurch die wichtige Hypothese, dass AML-LSCs über duale Triplebodies gezielt eliminiert werden können, weiter zu untermauern.

Stand der Forschung

In der Therapie der AML werden mit etablierten Protokollen Remissionsraten von bis zu 70% erreicht1,2. Die Therapieerfolge sind jedoch oft nicht langanhaltend, und die meisten Patienten versterben an chemo-resistenter Krankheit, ausgehend vermutlich von AML-LSCs, die besonders resistent gegen Chemotherapeutika sind3. Es besteht somit erheblicher Bedarf an der Entwicklung potenterer Therapeutika und Behandlungsverfahren, die möglichst auch die LSCs mit eliminieren sollten.

Zur Behandlung der AML ist in den USA ein Immuntoxin zugelassen, (MylotargTM), ein Konjugat aus einem CD33 Ak und dem Toxin Calicheamycin4. Trotz erheblicher Toxizitäten, die zu seiner Rücknahme vom Markt geführt haben, hat Mylotarg beachtliche klinische Erfolge erzielt, insbesondere bei Kindern mit CD33-positiver Leukämie4,5. CD33 ist somit ein klinisch validiertes Zielantigen zur Ak-Therapie der AML. Es liegt in Dichten von einigen 103-104 Molekülen pro Zelle auf den malignen Zellen von ca. 80% der AML Patienten vor. Im gesunden Organismus wird CD33 ausschließlich im hämatopoietischen System exprimiert und ist u.a. deshalb ein besonders gut geeignetes Zielantigen für eine Ak-Therapie. Ein Teil der normalen hämatopoietischen Stammzellen (HSC) ist CD33-negativ, bleibt von CD33-spezifischen Therapeutika verschont, und steht nach Abschluss der Therapie zur hämatologischen Rekonstitution zur Verfügung6. Eine Untergruppe der normalen HSC und der AML-LSC exprimiert CD336-8. Mehrere Firmen (u.a. SeattleGenetics, Micromet, Affimed, Sanofi-Aventis) entwickeln CD33-spezifische Ak-Therapeutika, z.B. den Ak "Lintuzumab" und einen rekombinanten bispezifischen "BiTE": CD33-CD3.

CD123, die α-Kette des IL-3 Rezeptors (IL3-R), liegt auf Granulozyten, Monozyten, Megakaryozyten und den meisten myeloischen Vorläuferzellen vor6-8. Der heterodimere IL3-R bestehend aus einer α- und einer β-Kette, CD123 und CD131, liegt auf multipotenten Vorläuferzellen der Hämatopoiese vor, auf "committed progenitors", auf myeloischen Leukämie-Zellen sowie auf den Zellen einiger prä-B-Zell Leukämien und B-Zell Lymphome. Nach Bindung von IL-3 wird der Rezeptor-Ligand Komplex internalisiert. Daher ist CD123 ein geeignetes Zielantigen zum Design von Immuntoxinen. DT 388-IL3, ein Fusionsprotein aus IL-3 mit dem bakteriellen Toxin DT388 (Diphtherie-Toxin Fragment), war in klinischen Studien erfolgreich und wird weiter verfolgt9,10. Das Team der Hämatologie und Onkologie und andere haben CD123-spezifische Fusionsproteine mit dem bakteriellen Toxin Pseudomonas Exotoxin A studiert, die in vitro sehr potent sind. CD123 ist auf AML-LSCs ca. in ca. 5- bis 10-fach höherer Oberflächen-Dichte als auf normalen HSCs exprimiert und sollte somit ein präferentielles Targeting der LSCs ermöglichen6,11,12. Ein CD123 Ak der Firma CSL wurde in einer klinischen Studie gegen die AML getestet. Da sowohl CD123 (durch DT 388-IL3) als auch CD33 (durch Mylotarg) klinisch validierte Targets zur Therapie der AML sind, ergibt sich die Erwartung, dass ein gegen die Kombination (CD33+CD123) gerichteter Triplebody 33-16-123 ebenfalls erfolgreich und möglicherweise noch erfolgreicher sein sollte.

Triple-Antibody

Abb. 1 Single chain Triplebodies: Wirkmechanismus.

Effektorzell-abhängige Lyse von Krebszellen (ADCC). Die Krebszelle trägt 2 Populationen unterschiedlicher Antigene Ag1, Ag2 auf ihrer Oberfläche.  Der Triplebody hat 2 Bindestellen für diese und kann gleichzeitig an je eines dieser Antigene auf derselben Zelle binden. Mit seiner 3. Bindestelle rekrutiert er eine Effektorzelle. Krebszelle und Effektorzelle werden durch mehrere Triplebody Moleküle verklettet. Die Effektorzelle wird dadurch aktiviert und schüttet zytotoxische Speicherstoffe aus, welche die Krebszelle töten.

Das Triplebody-Format (Abb.1) bietet einen dreifachen Vorteil vor den bisher entwickelten bispezifischen single chain Fv Ak-Fragmenten (bsscFvs), die nur je einen single chain Fv (scFv) Bindekopf für ein Zielantigen auf der Krebszelle und ein Triggermolekül auf der Effektorzelle tragen13:

  1. Durch die gleichzeitige Bindung mit 2 Bindeköpfen an die Krebszelle wird ein Aviditätseffekt erzielt, d. h. die Bindestärke des Moleküls an die Krebszelle wird beträchtlich gesteigert. Durch diesen Effekt wird die halbmaximale Effektor-Konzentration (EC50) stark verbessert, die Konzentration, bei der der Wirkstoff die Hälfte seiner maximalen anti-leukämischen Aktivität in ADCC (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity) Reaktionen in vitro entfaltet. Sie wird durch die Hinzunahme der zweiten Bindestelle für ein Krebsantigen um das 20- bis 200-Fache gesenkt, so dass sie im niedrigen picomolaren Bereich liegt14-16. Dies bedeutet, dass Triplebodies voraussichtlich in Dosen von ca.10 µg/kg Körpergewicht verabreicht werden können, während Aks in bis zu 1000-fach höheren Dosen eingesetzt werden (Rituximab: 10 mg/kg). Dadurch sollten Nebenwirkungen und Kosten stark gesenkt werden.

  2. Die beiden Bindestellen für Tumorantigene können gegen 2 verschiedene Antigene auf derselben Zelle gerichtet sein (Abb.1).  Dieses "Duale Targeting" bietet einen zusätzlichen Vorteil. Dadurch nämlich kann eine präferentielle Bindung an doppelt-positive (dp) Zellen im Vergleich zu einfach positiven (sp) Zellen, die nur eines der beiden Antigene tragen, erzielt werden18,19.  Dadurch sollte ein bevorzugtes Ansteuern von LSCs vor normalen Gewebestammzellen und Bulk-Leukämiezellen im Prinzip erreichbar sein. Bisher publizierte Triplebodies sind: 19-16-19, 33-16-33, 123-16-33, 123-16-123, 33-16-19 und HLA-DR-16-1914-19. Diese Proteine eliminierten Leukämie-abgeleitete Zelllinien und Zellen aus Knochenmark und peripherem Blut von Patienten sehr effizient.  Für den Triplebody HLA-DR-16-19 wurde ferner gezeigt, dass durch Duales Targeting eine bevorzugte Bindung an Antigen dp vor gleichzeitig vorliegenden sp Zellen und auch eine bevorzugte NK-Zell vermittelte Lyse erzielbar waren18,19.  Diese "Selektivität" für dp Zellen eröffnet attraktive neue Möglichkeiten in der Krebstherapie, weil bisher verfügbare Chemotherapeutika keine vergleichbare Selektivität für Tumorzellen vor normalen Zellen zeigen und somit mit unerwünschten systemischen Nebenwirkungen behaftet sind.

  3. Die Plasma-Halbwertszeit der Triplebodies ist ca. doppelt so lang wie die der bsscFvs14.
    Die Summe dieser Eigenschaften lassen das Triplebody Format als ein sehr attrakti-ves Format zur Entwicklung neuer Ak-Derivate gegen die AML erscheinen.
    Die französische GOELAMS-Gruppe berichtete, dass Patienten, die zum Zeitpunkt der Diagnose einen besonders hohen Anteil (>1%) an CD123pos Zellen im Kompartiment ihrer AML-Stammzellen (CD34 pos CD38 neg) trugen, einen besonders ungünstigen Krankheitsverlauf hatten (Abb. 2) im Vergleich zu denen, die <1% CD123pos Zellen in diesem Kompartiment trugen.  Die Autoren vermuteten daher, dass die 123pos Zellen in diesem Kompartiment den AML-LSCs oder zumindest den MRD-Zellen entsprechen, die für ein frühes Rezidiv verantwortlich sind. Sie schlagen vor, wenn diese Befunde weiter bestätigt würden, dass man den Test auf die Frequenz der 34pos 38neg 123pos mutmaßlichen MRD-Zellen bereits zum Zeitpunkt der Diagnose durchführen sollte. Wenn dann der Patient in die ungünstige Risikogruppe fällt (>1% 123pos), dann sollte man ihn vielleicht bereits mit einer adaptierten Induktionstherapie behandeln, welche Agentien wie die hier entwickelten umfassen sollte, die 123pos Zellen gezielt zu eliminieren versuchen.
    Das Programm des vorliegenden Projekts beruht auf eigenen Vorarbeiten und der GOELAMS Studie und versucht, Wirkstoffe zur Verfügung zu stellen, die den dort definierten Anforderungen genügen.

Survival1

Abb. 2 AML Patienten, die zum Zeitpunkt der Diagnose einen hohen Anteil an 123pos Zellen im Kompartment der 34pos 38neg AML-    Stammzellen tragen, haben eine schlechte Prognose. Blau: Kaplan Meyer Plot für Patienten mit <1% 123-pos Zellen im Stammzell-Kompartment; rot: Patienten mit > 1% 123pos. Aus Vergez 2011 (Ref. 20). Links: disease free survival; rechts: overall survival für alle 111 Patienten der Studie.

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