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Technologieplattform zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen

Protein-Protein-Interaktionsstudien stehen im Brennpunkt der aktuellen Proteomforschung, da sie zum Verständnis grundlegender physiologischer und krankheitsverursachender Prozesse beitragen. Hierdurch steigt der Bedarf an sensitiven und validen Hochdurchsatzmethoden zur Detektion von Protein-Protein-Interaktionen. Wir haben eine neue Methode zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen auf einem automatisierten Robotersystem etabliert. Diese ist als flexibler Hochdurchsatz-Interaktionsassay auf eine Vielzahl weiterer Fragestellungen anwendbar.

Von der Interaktion zur Funktion

Protein-Protein-Interaktionsstudien (PPI) stehen im Brennpunkt der aktuellen Proteomforschung. Sie bilden die Grundlage für die Identifikation von sogenannten Interaktionsnetzwerken (Interaktome). Die Kartierung und Analyse dieser Interaktome ermöglicht einen Einblick in die komplexen regulatorischen Netzwerke, die der Zellfunktion zugrunde liegen. Dies führt sowohl zum Verständnis grundlegender physiologischer Prozesse, als auch zu Erkenntnissen, wie Krankheit entstehen kann. Beispielsweise können Fehlfunktionen der untersuchten Proteine aufgedeckt oder Mechanismen der Integration pathogener Organismen in das Interaktom des Wirtes aufgeklärt werden.

 


LMUexcellent fördert die Entwicklung innovativer Technologien

Gefördert durch die Mittel der bundesweiten Exzellenzinitiative (LMUexcellent) wurde im Rahmen einer Kooperation mit Prof. Dr. Dr. Jürgen Haas und Prof. Dr. Ulrich Koszinowski (Max von Pettenkofer-Institut der LMU München) ein Projekt zum Thema „Untersuchung von Proteininteraktionen mittels Hochdurchsatzverfahren in der Biomedizin: ein interdisziplinärer Ansatz“ aufgebaut. In den letzten zwei Jahren gelang den Forschern der Molekularen Pädiatrie die Entwicklung und Etablierung einer informatikgestützten, auf dem Prinzip des Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfers (BRET) basierenden Methode zur Untersuchung von PPI. Diese neue Technologie erlaubt PPI-Experimente im Hochdurchsatzverfahren in der lebenden Zelle und gewährleistet eine im Vergleich zu bisher verfügbaren Datensätzen erhöhte Aussagekraft.

BRET-Schema

Abbildung BRET-Schema

Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) beruht auf einem Energietransfer, der im Falle einer Interaktion zweier Proteine bei Anregung des Donor-Proteins (Rluc-markiert) auf das Akzeptor-Protein (YFP-markiert) erfolgt. Das Emissionssignal des Akzeptors wird detektiert. Die Anregung erfolgt durch Umsetzung eines Substrates (Biolumineszenz). Voraussetzung für den Energietransfer ist eine räumliche Nähe von Donor und Akzeptor innerhalb des Försterradius (100 Å).

 


Untersuchungen im Hochdurchsatz

Um BRET im Hochdurchsatz anwenden zu können, wurden zeitökonomische Klonierungsstrategien sowie eine Hochdurchsatztransfektions- und detektionsmethode etabliert. Die nun erreichten Optimierungen erlauben die verlässliche Messung des BRET-Signals auch im kleinen Maßstab, der für die Anwendung in Hochdurchsatzsystemen Voraussetzung ist. Einen entscheidenden Vorteil unserer Technologie gegenüber anderen Hochdurchsatzmethoden zur Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen stellt die Messung des BRET-Signals in lebenden Zellen dar. Hierdurch wird die biologische Relevanz der identifizierten PPI deutlich erhöht und die Detektion artifizieller Interaktionen von Proteinen weitgehend unterbunden. Inzwischen wird der gesamte analytische Prozess mit Hilfe einer spezifisch für das Projekt entworfenen Roboteranlage automatisiert durchgeführt. Die Roboteranlage beruht auf einer Tecan Freedom Evo 200 Workstation, in die ein Lonza Nucleofektor 96-well Shuttle System (Transfektion) und ein BMG LUMIstar OPTIMA Mikroplatten-Reader (Detektion) intergriert wurden.

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Abbildung Roboter

 


Validierung

Die Methode wird mittels statistischer und bioinformatischer Methoden validiert. Dazu werden die Ergebnisse mit den bereits publizierten Resultaten anderer experimenteller Technologien, unter anderem dem Yeast-Two-Hybrid System, verglichen. Bioinformatische Algorithmen spielen bei der Validierung eine entscheidende Rolle.

 


Anwendung und Nutzen

Das Verfahren soll zunächst modellhaft zur Untersuchung von Interaktionen zwischen sämtlichen Proteinen eines zellulären Kompartimentes angewandt werden. Dadurch sollen Schlüsselprozesse bei genetischen Stoffwechselerkrankungen identifiziert und deren pathogenetische Mechanismen aufgeklärt werden. Darüber hinaus bietet die vielseitige Methode eine problemlose Anwendung auf eine Vielzahl weiterer Fragestellungen.

Zusammenfassend beinhaltet die neue Technologie mit Modellcharakter ein erhebliches Anwendungspotential sowohl für die Forschung als auch für die industrielle Anwendung, insbesondere bei der Entwicklung pharmazeutischer Produkte. Unser Ziel ist es, Grundlagenforschungsprojekte in die produktorientierte medizinische Anwendungsforschung zu übertragen, um so eine spürbare Verbesserung der Versorgung und der Lebensqualität von Kindern mit angeborenen Stoffwechselstörungen zu erreichen.