PI Ries

Klinische Pathobiochemie

 

Matrix-Metalloproteinasen-assoziierte Regulationsmechanismen bei migrierenden Zellen.

Matrix metalloproteinase-associated regulatory mechanisms in migrating cells.

Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und ihre natürlichen Inhibitoren (tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs) spielen eine wichtige Rolle in vielen (patho-)physiologischen Prozessen, die u.a. mit Zellmigration und Gewebedestruktion, insbesondere mit dem Abbau der extrazellulären Matrix (EZM) verbunden sind. Von herausragender Bedeutung in diesem Zusammenhang ist die Fähigkeit von MMP-9 und MMP-2, Kollagen Typ IV, den Hauptbestandteil von Basalmembranen, zu degradieren. Der lokale Abbau von EZM-Strukturen stellt eine wesentliche Voraussetzung für Immun, Stroma-, Stamm- und Tumorzellen dar, um entsprechende Migrationsbarrieren überwinden zu können. Darüberhinaus besitzen MMPs und TIMPs auch wichtige regulatorische Funktionen. So etwa überführen MMPs Signalproteine wie Chemokine und Zytokine durch proteolytische Spaltung in einen aktiven oder inaktiven Zustand und beeinflussen auf diese Weise essentielle zelluläre Prozesse wie Migration, Proliferation und Differenzierung. TIMPs üben unabhängig von ihrer Hemmwirkung auf MMPs auch Wachstumsfaktor-ähnliche Funktionen bei verschiedenen Zellen aus, wobei die hier zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen noch weitgehend ungeklärt sind.

Ziel unserer Forschungstätigkeit ist es, tiefere Einblicke in die Regulation und Funktionsweise von MMPs und TIMPs in migrierenden Zellen, insbesondere Monozyten/Leukämiezellen (THP-1), humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) und primären humanen Keratinozyten sowie Fibroblasten zu gewinnen. Die zu erwartenden Ergebnisse sollen Hinweise auf innovative Therapieoptionen geben, die es ermöglichen, pathologische Prozesse wie Atherosklerose, Neoplasie oder Wundheilungsstörungen zu beeinflussen.

Ausgewählte Resultate der Arbeitsgruppe:

Monozyten/Leukämiezellen (Thomas Pitsch, BTA):

Bei Untersuchung der Zellextrakte von THP-1-Zellen gelang die Identifizierung einer neuartigen Zellmembran-gebundenen proMMP-9-Variante mit einer im Vergleich zur sezernierten 94-kDa-proMMP-9 verminderten Molekülmasse von 82 kDa. Die vergleichende biochemische Charakterisierung der gereinigten proMMP-9-Formen ergab, dass sich die Membran-assoziierte proMMP-9 durch ein verändertes Glykosylierungsmuster und eine Verkürzung am N-Terminus auszeichnet. Interessanterweise degradiert ihre mit 35 kDa ungewöhnlich kleine aktive Form typische MMP-9-Substrate, weist aber eine deutlich reduzierte Hemmbarkeit durch den natürlichen MMP-9-Inhibitor TIMP-1 auf. Diese besonderen Eigenschaften der Zellmembran-gebundenen 82-kDa proMMP-9 dürften möglicherweise das Invasionsverhalten der Zellen begünstigen. Durch Applikation synthetischer niedermolekularer MMP-Inhibitoren können jedoch die sezernierte und die Membran-assoziierte MMP-9-Form gleichermaßen effizient gehemmt werden, was die therapeutische Wirksamkeit derartiger Inhibitoren wahrscheinlich macht. Gegenwärtig erfolgen Analysen zur Biogenese und Funktion der 82-kDa proMMP-9-Variante sowie Untersuchungen zur Expression in verschiedenen Zell- und Gewebetypen unter Verwendung selbst generierter monoklonaler Antikörper gegen die MMP-9-Variante.

  • Ries C, Pitsch T, Mentele R, Zahler S, Egea V, Nagase H, Jochum M. Identification of a novel 82-kDa variant of proMMP-9 associated with the surface of leukaemic cells: (auto-)catalytic activation and resistance to inhibition by TIMP-1. Biochemical Journal, 405:547-558, 2007.

 

Humane mesenchymale Stammzellen (Dr. Virginia Egea, Dipl.-Biol. Christian Mahl):

Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) werden im Knochenmark gebildet und verlassen dieses gezielt, um in entzündete oder verletzte Organe zu wandern. Dort tragen hMSC in vielfältiger Weise zur Regeneration der Gewebe bei, etwa durch Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen (Immunmodulation) oder auch durch Ausdifferenzierung in spezielle Zelltypen.

Für unsere Untersuchungen der gerichteten Wanderung von Zellen etablierten wir einen in vitro-Assay, der als Migrationsbarriere auf der Verwendung humaner extrazellulärer Matrix (EZM) basiert, die in ihrer Zusammensetzung den Basalmembranen entspricht. Anhand dieses Modells ließ sich zeigen, dass hMSC im Stande sind, diese Barriere einem chemotaktischen Gradienten folgend zu durchwandern, wobei sich die Fähigkeit der Zellen zur Biosynthese von MMP-2, MT1-MMP und TIMP-2 als ausschlaggebend dafür erwies, die Basalmembranstrukturen überwinden zu können. Eine deutliche Verstärkung der MMP-abhängigen invasiven Eigenschaften von hMSC war unter Einwirkung der inflammatorischen Zytokine TGF-β, IL-1β, und TNF-α sowie des Chemokins SDF-1α zu beobachten, die auf hMSC als starke chemotaktische Lockstoffe wirken. Diese Resultate beschreiben einen potentiellen Mechanismus, der unter physiologischen Bedingungen eine Mobilisierung von hMSC aus dem Knochenmark in verletzte oder entzündete Bereiche von Organen erlauben könnte, um so die Regeneration der Gewebe zu fördern.

  • Ries C, Egea V, Karow M, Kolb H, Jochum M, Neth P. MMP-2, MT1-MMP, and TIMP-2 are essential for the invasive capacity of human mesenchymal stem cells: differential regulation by inflammatory cytokines. Blood, 109:4055-4063, 2007.

Unsere Studien zur Rolle von TIMP-1 bei hMSC belegen, dass die hohe endogene Expression von TIMP-1 in den Zellen das Wachstum und die osteogene Differenzierung durch eine negative Modulation des Wnt/β-Catenin-Signalweges unterdrückt. Ausgelöst wird dieser supprimierende Effekt durch Interaktion von TIMP-1 mit CD63 auf der Zelloberfläche. Dies erfolgt unabhängig von der MMP-inhibierenden Wirkung von TIMP-1. Eine zentrale Rolle in dem molekularen Netzwerk der TIMP-1-vermittelten Effekte in hMSC spielt die microRNA let-7f. In Abwesenheit von TIMP-1 akkumuliert let-7f in den Zellen und hemmt so die Translation von Axin-2, einem Antagonisten der ß-Catenin-Aktivität. Zusammengefasst zeigen die Resultate dieser Untersuchungen, dass TIMP-1 ein Modulator wichtiger Stammzellfunktionen ist, und sie belegen die Existenz eines regulatorischen Netzwerkes, in dem let-7f die Aktivität des Wnt/β-Catenin-Signalweges beeinflusst (Abb. 1)

 

Ries TIMP1

Abbildung 1: Modell der TIMP-1-vermittelten Hemmung des Wnt/β-Catenin-Signalweges durch die microRNA let-7f in hMSC.

 

  • Egea V, Zahler S, Rieth N, Neth P, Popp T, Kehe K, Jochum M, Ries C. Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) regulates mesenchymal stem cells through let-7f microRNA and Wnt/ß-catenin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A 109(6):E309-16, 2012.

 

Gegenwärtig untersuchen wir die Rolle des membranständigen MMP-Inhibitors reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs (RECK) in hMSC. Resultate aus Knockdown-Experimenten weisen darauf hin, dass die konstitutive Expression von RECK den osteogenen Reifungsprozess von hMSC fördert, jedoch einen hemmenden Einfluß auf die adipogene Differenzierung und die Fähigkeit der Zellen ausübt, Barrieren aus extrazellulärer Matrix zu durchwandern.

 

Primäre Hautzellen (Dr. Tanja Popp, Dipl. Biol. Janina Deppe)

S-Lost ist ein chemischer Kampfstoff, der bei Kontakt mit der Haut eine drastische Gewebezerstörung und stark verzögerte Heilung dieser Verletzungen zur Folge hat. Für eine gezielte Wundbehandlung sind daher detaillierte Kenntnisse der zugrunde liegenden Pathomechanismen ausschlaggebend.

In Kooperation mit dem Sanitätsamt der Bundeswehr konnten wir nachweisen, dass es nach Einwirkung von S-Lost auf Keratinozyten zur Freisetzung eines löslichen Faktors kommt, der Fibroblasten in parakriner Weise zur vermehrten Sekretion von MMP-9 stimuliert und die Invasivität der Zellen erhöht. Möglicherweise trägt dieser Mechanismus durch eine MMP-9-bedingte Zerstörung von Basalmembranen zu der extensiven Blasenbildung bei, wie sie nach Exposition der Haut mit S-Lost auftritt.

  • Ries C, Popp T, Egea V, Kehe K, Jochum M. Matrix metallo¬proteinase-9 expression and release from skin fibroblasts interacting with keratinocytes: upregulation in response to sulphur mustard. Toxicology, 263:26-31, 2009.

Darüberhinaus konnten wir beobachten, dass es nach Kontakt von Keratinozyten mit S-Lost zu einer vorzeitigen Ausdifferenzierung der Zellen kommt, die dann möglicherweise nicht mehr adäquat zur Wundheilung beitragen können. Verantwortlich für die Differenzierungsinduktion ist eine S-Lost-bedingte Hochregulation der MAP-Kinase-Aktivitäten von p38 und ERK1/2. Dabei kommt die zentrale regulatorische Funktion jedoch der Kinase p38 zu, die ihrerseits durch ERK1/2 negativ beeinflusst wird. Tatsächlich gelang es, die durch S-Lost verursachte Hemmung der Invasionsfähigkeit von Keratinozyten durch Applikation eines p38-Inhibitors aufzuheben. Möglicherweise tragen diese Mechanismen zu den Wundheilungsstörungen bei, die nach Exposition der Haut mit S-Lost zu beobachten sind.

  • Popp T, Egea V, Kehe K, Steinritz D, Schmidt A, Jochum M, Ries C. Sulfur mustard induces differentiation in human primary keratinocytes: opposite roles of p38 and ERK1/2 MAPK. Toxicology Letters 204:43-51,2011

 

Aktuell untersuchen wir in Keratinozyten und Fibroblasten den Einfluss von S-Lost auf die Expression von HIF1α, den Hauptakteur des HIF-Signalweges. Der spielt bei Sauerstoffmangel (Hypoxie), eine wichtige Rolle für Wachstum und Mobilisierung von Stamm- und Progenitorzellen, indem er Prozesse wie Proliferation, Angiogenese, aber auch Autophagie und Apoptose steuert. Details zu diesen vom Sanitätsamt der Bundeswehr geförderten Projekten finden sich auch unter Project Funding

Arbeitsgruppenleiter:

Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Christian Ries

 
 
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Direktor: Prof. Dr. med. Christian Weber

Institut für Prophylaxe und Epidemiologie der Kreislaufkrankheiten (IPEK)

 

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